Einleitung
HPLC sagt euch, wie rein ein Peptid ist. ESI-MS sagt euch, welches Peptid es ist. Beide Methoden sind komplementär, und nur ihre Kombination liefert eine vollständige Charakterisierung.
Dieser Beitrag erklärt das ESI-MS-Prinzip, wie wir es zur Identitätsbestätigung nutzen und welche Stolperfallen bei der Interpretation zu beachten sind.
Prinzip: Ionisation per Elektrospray
Bei der Electrospray Ionization wird die Peptidlösung durch eine feine Kapillare in ein elektrisches Feld gesprüht. Die entstehenden Tröpfchen verdampfen, das Peptid bleibt als geladenes Ion zurück und wird ins Massenspektrometer geleitet.
Wichtig zu wissen:
- Multipel geladene Ionen sind die Norm bei Peptiden, typisch
[M+2H]²⁺oder[M+3H]³⁺. - Die gemessenen m/z-Werte müssen zurück zur monoisotopischen Masse umgerechnet werden.
- Adduct-Bildung mit Na⁺, K⁺ oder NH₄⁺ ist häufig und darf nicht mit echten Verunreinigungen verwechselt werden.
Massenberechnung in der Praxis
Beispiel: Tirzepatide hat eine theoretische monoisotopische Masse von 4811,52 Da. Im ESI-MS erscheint typisch:
TEXT[M+3H]³⁺ → m/z = (4811,52 + 3·1,00728) / 3 = 1604,85
[M+4H]⁴⁺ → m/z = (4811,52 + 4·1,00728) / 4 = 1203,89
[M+5H]⁵⁺ → m/z = (4811,52 + 5·1,00728) / 5 = 963,31
Eine korrekte Identifikation liegt vor, wenn mindestens zwei Ladungszustände mit der erwarteten Masse innerhalb von ± 1 Da übereinstimmen.
[!NOTE] Bei Massen über 5000 Da steigt die Wahrscheinlichkeit für Isotopen-Überlappungen. Hochauflösende MS (Orbitrap, FT-ICR) ist dann genauer als ein klassisches Quadrupol; wir nutzen Letzteres als Standard, weil es für die Identitätsbestätigung bei unseren Peptidgrößen ausreichend ist.
Was MS nicht kann
- Quantifizieren (das macht UV-HPLC)
- Stereoisomere unterscheiden (D vs. L, cis vs. trans)
- Disulfid-Bindungen direkt nachweisen, ohne Reduktion
- Salze ausblenden; eine TFA-Counterion-Variante kommt unter Umständen als separates Signal
Typische Fallstricke
- Adducts:
[M+Na]⁺ist 22 Da schwerer als[M+H]⁺und sieht schnell aus wie eine Verunreinigung. Lösung: gegen Adduct-Tabelle abgleichen. - TFA-Suppression: TFA in der Mobilphase drückt die Sensitivität deutlich. Bei MS-Workflows besser FA verwenden (siehe Artikel zur Mobilphase).
- In-source-Fragmentation: zu hohe Source-Voltage zerschlägt das Peptid bereits in der Source. Erkennbar an einem Fragmentmuster statt am Molekül-Peak.
Eine MS-Identitätsbestätigung sagt nicht „die Charge ist gut", sondern „die Charge enthält das erwartete Molekül". Reinheit, Stabilität und biologische Aktivität sind eigene Tests.
Unsere Verifikations-Pipeline
- HPLC-UV → Reinheit > 98 % (sonst Reject)
- ESI-MS → mindestens zwei Ladungszustände innerhalb von ± 1 Da der erwarteten Masse (sonst Reject)
- Beide Reports zusammen im CoA; kein „nur HPLC" oder „nur MS"
[!WARNING] Eine Charge, die nur einen der beiden Tests besteht, wird nicht freigegeben. Wer eine CoA ohne MS-Bestätigung sieht, sollte nachfragen.
[!IMPORTANT] Forschungsgebrauch: Inhalte dieses Artikels beziehen sich auf analytische In-vitro-Anwendungen. Keine Empfehlung für Anwendung am Menschen oder Tier.